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斑點雜交實驗服務實驗注意事項

實驗技術(shù)簡介:斑點雜交(Dotblot) 是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。- 張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀(Manifold) , 如MinifoldI和II. Smart Botter(Wealtec).Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。

實驗技術(shù)原理:

斑點雜交是指將待測的DNA變性后點加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜、NC膜)上, 用已標記的探針進行雜交，洗膜(除去未接合的探針)， 放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。

實驗操作流程:

1. DNA斑點雜交

①先將膜在水中浸濕，再放到15*SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min,冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標好位置將DNA點樣于膜上，每個樣品-般點5ul(2~10μg DNA)。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/span>

2、RNA斑點雜交

與上法類似、，每個樣品至多加10μg總RNA (經(jīng)酚/氨0仿或異硫青酸胍提取純化)。 方法是將RNA溶于5μl DEPC水，加5μI甲醛/SSC緩沖液(10*SSC中含6.15moI/L甲醛) ，使RNA變性，然后取5-8μI點樣于處理好的濾膜上，烘干。

3、完整細胞斑點雜交

應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。

實驗注意事項:

客戶提供:

TotalRNA (DNA) ≥20ug,濃度> 1ug/ul, A260/A280>1.8;提供標記后的探針，需同時告知標記后探針的濃度及活性，待檢測目的基因的Genbank序列號。

交付標準:

1、圖片

2.完整項目報告(材料、試劑、儀器、方法、數(shù)據(jù)分析、實驗結(jié)果)

其他:

1.點樣量不要太大，否則雜交后，X光片上點太大，互相影響。

點樣前尼龍膜無需預處理，點樣后自然晾干后， 分別在變性液和中和液中進行變性和中和。

收費標準/服務周期/提供結(jié)果:

歡迎咨詢詳談，我們會根據(jù)您的方案及需求制定詳細的服務協(xié)議。

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